PK-59（人胰腺癌細胞）

二、細胞接收后的處理

1) 收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于室溫放置約1h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯(lián)系我們。

2) 請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀態(tài)，同時給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細胞狀態(tài)的依據(jù)。

3) 貼壁細胞：細胞在室溫中放置1h，顯微鏡下觀察細胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的玩全培養(yǎng)基6-8mL，放到細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細胞生長密度達70%-80%以上，可以對細胞進行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收。

4) 細胞運輸途中脫落操作方法：把脫落的細胞收集離心后棄上清，用PBS清洗一遍，離心棄上清，在離心管中加入1ml咦酶吹散消化20秒左右，加玩全培養(yǎng)基終止消化后離心重新鋪平，剩下的貼壁細胞就按照正常貼壁細胞傳代方法操作。

5) 備注：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的玩全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。  收到細胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。

三、細胞培養(yǎng)操作

1) 復(fù)蘇細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主

將含有1 mL細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤? cm皿中，加入約4 mL玩全培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第三天換液并檢查細胞密度。

2) 細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

a) 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。          

b) 加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.02?TA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 -3min（視細胞消化情況而定），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加2-3ml玩全培養(yǎng)基終止消化。

c) 輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心5 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。          

d) 將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

貼壁細胞傳代注意點：

l 一定要PBS洗一遍。

l 細胞多觀察幾次掌握時間，不要在細胞沒有基本脫落就終止消化然后吹打下來，這樣細胞  更容易分化和死亡。

l 不要一直對細胞吹打

3) 細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為例；

a) 收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。

b) 根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度1×10^6~1×10^7/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

c) 將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

四、培養(yǎng)注意事項

1) 細胞出現(xiàn)問題，予以重發(fā)情況

a) 細胞運輸途中遭遇的各種問題，細胞丟失、瓶身破損、培養(yǎng)液嚴重漏液等，重發(fā)；

b) 細胞污染問題，請在收到產(chǎn)品3 天內(nèi)，給我們提出真實的實驗結(jié)果，核實后重發(fā)；

c) 常溫發(fā)貨的細胞靜置2小時后，干冰凍存發(fā)貨的細胞復(fù)蘇后2 天后，絕大多數(shù)細胞未存活，（需提供真實清晰的細胞狀態(tài)照片），重發(fā)；

d) 干冰凍存發(fā)貨的細胞復(fù)蘇后2天后或常溫發(fā)貨的細胞靜置2 小時候并且未開封，出現(xiàn)污染，重發(fā)；

e) 細胞活性問題，請在收到產(chǎn)品7天內(nèi)給我們提出真實的實驗結(jié)果，用臺盼藍染色法鑒定細胞活力，和每天的細胞照片，核實后予重發(fā)；

f) 細胞收到當(dāng)天以及第2,3 天請拍照，3 天未告知的，視為產(chǎn)品合格。4-7 天內(nèi)出現(xiàn)問題需提供收到細胞前3天照片和細胞出現(xiàn)問題的照片以及細胞相關(guān)操作的詳細步驟，并跟技術(shù)人員溝通的，由技術(shù)人員判定為我方責(zé)任的，重發(fā)。

2) 細胞出現(xiàn)問題，不予以重發(fā)的情況

a) 客戶操作造成細胞污染，不重發(fā)；

b) 客戶嚴重操作失誤致細胞狀態(tài)不好，不重發(fā)；

c) 非我們推薦細胞培養(yǎng)體系致的細胞狀態(tài)不好，不重發(fā)；

d) 細胞狀態(tài)不好，未提供真實清晰的培養(yǎng)前3 天的細胞狀態(tài)照片，不重發(fā)；

e) 細胞培養(yǎng)時經(jīng)其它處理導(dǎo)致細胞出現(xiàn)問題的，不重發(fā)；

f) 收到細胞并發(fā)現(xiàn)問題與客服人員溝通的時間證明大于7 天的，不重發(fā)；

g) 視具體情況而定。

五、注意事項

1. 所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2. 建議在復(fù)蘇凍存細胞時始終使用防護手套、衣服和戴上防護面罩。注意：凍存管浸沒在液氮中會泄漏，并會慢慢充滿液氮。解凍時，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子，從而產(chǎn)生飛揚的碎屑造成人員傷害。

3. 該細胞僅供科研使用！說明書僅供參考以實際到貨說明書為準！