RNAi實(shí)驗(yàn)原理與方法

實(shí)驗(yàn)原理

通過(guò)生化和遺傳學(xué)研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應(yīng)階段(inititation and effector steps)。在起始階段，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長(zhǎng)的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。證據(jù)表明；一個(gè)稱為Dicer的酶，是RNase III家族中特異識(shí)別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個(gè)片段的3’端都有2個(gè)堿基突出。

在RNAi效應(yīng)階段，siRNA雙鏈結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一個(gè)ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過(guò)程。激活的RISC通過(guò)堿基配對(duì)定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3’端12個(gè)堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機(jī)制尚不明了，但每個(gè)RISC都包含一個(gè)siRNA和一個(gè)不同于Dicer的RNA酶。

另外，還有研究證明含有啟動(dòng)子區(qū)的dsRNA在植物體內(nèi)同樣被切割成21-23nt長(zhǎng)的片段,這種dsRNA可使內(nèi)源相應(yīng)的DNA序列甲基化,從而使啟動(dòng)子失去功能,使其下游基因沉默.

實(shí)驗(yàn)試劑

 RNase III、 DNA Oligo、Taq酶、dNTP、氯化鈣、磷酸緩沖液、克隆所需試劑、 siRNA合成試劑盒等

實(shí)驗(yàn)步驟

(一)siRNA的設(shè)計(jì)

1. 在設(shè)計(jì)RNAi實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以先在以下進(jìn)行目標(biāo)序列的篩選：

1.       RNAi目標(biāo)序列的選取原則：

(1)從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開(kāi)始，尋找“AA”二連序列，并記下其3'端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示GC含量在45%—55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。

Tuschl等建議在設(shè)計(jì)siRNA時(shí)不要針對(duì)5'和3'端的非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。

(2)將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。

例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）

(3)選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，以找到zui有效的siRNA序列。

3.陰性對(duì)照

一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有陰性對(duì)照，作為陰性對(duì)照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒(méi)有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和目的靶細(xì)胞中其他基因沒(méi)有同源性。

4.目前已證實(shí)的siRNA可以在下面的網(wǎng)頁(yè)找到：

(二)siRNA的制備

目前為止較為常用的方法有通過(guò)化學(xué)合成，體外轉(zhuǎn)錄，長(zhǎng)片斷dsRNAs經(jīng)RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)體外制備siRNA，以及通過(guò)siRNA表達(dá)載體或者病毒載體，PCR制備的siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生siRNA。

體外制備

1.化學(xué)合成

許多國(guó)外公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。主要的缺點(diǎn)包括價(jià)格高，定制周期長(zhǎng)，特別是有特殊需求的。由于價(jià)格比其他方法高，為一個(gè)基因合成3—4對(duì)siRNAs 的成本就更高了，比較常見(jiàn)的做法是用其他方法篩選出zui有效的序列再進(jìn)行化學(xué)合成。zui適用于：已經(jīng)找到zui有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究。不適用于：篩選siRNA等長(zhǎng)時(shí)間的研究，主要原因是價(jià)格因素

2.體外轉(zhuǎn)錄

以DNA Oligo為模版，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成siRNAs，成本相對(duì)化學(xué)合成法而言比較低，而且能夠比化學(xué)合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實(shí)驗(yàn)的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs，但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學(xué)合成相比，還是需要占用研究人員相當(dāng)?shù)臅r(shí)間。值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs毒性小，穩(wěn)定性好，效率高，只需要化學(xué)合成的siRNA量的1/10就可以達(dá)到化學(xué)合成siRNA所能達(dá)到的效果，從而使轉(zhuǎn)染效率更高。zui適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學(xué)合成的價(jià)格成為障礙時(shí)。不適用于：實(shí)驗(yàn)需要大量的，一個(gè)特定的siRNA。長(zhǎng)期研究。

3.用RNase III 消化長(zhǎng)片斷雙鏈RNA制備siRNA

其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設(shè)計(jì)和檢驗(yàn)多個(gè)siRNA序列以便找到一個(gè)有效的siRNA。而用這種方法——制備一份混合有各種siRNAs “混合雞尾酒” 就可以避免這個(gè)缺陷。選擇通常是200—1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長(zhǎng)片斷雙鏈dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在體外消化，得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒(méi)有被消化的dsRNA后，這個(gè)siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，方法和單一的siRNA轉(zhuǎn)染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。

dsRNA消化法的主要優(yōu)點(diǎn)在于可以跳過(guò)檢測(cè)和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節(jié)省時(shí)間和金錢(qián)（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不過(guò)這種方法的缺點(diǎn)也很明顯，就是有可能引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關(guān)的基因?，F(xiàn)在多數(shù)的研究顯示這種情況通常不會(huì)造成影響。

zui適用于：快速而經(jīng)濟(jì)地研究某個(gè)基因功能缺失的表型

不適用于：長(zhǎng)時(shí)間的研究項(xiàng)目，或者是需要一個(gè)特定的siRNA進(jìn)行研究，特別是基因治療體內(nèi)表達(dá)前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs，并且需要專門(mén)的RNA轉(zhuǎn)染試劑將siRNAs轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)。而采用siRNA表達(dá)載體和基于PCR的表達(dá)框架則屬于：從轉(zhuǎn)染到細(xì)胞的DNA模版中在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到siRNAs。這兩種方法的優(yōu)點(diǎn)在于不需要直接操作RNA。

4. siRNA表達(dá)載體

多數(shù)的siRNA表達(dá)載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動(dòng)子(pol III)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。這三類啟動(dòng)子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動(dòng)子和人H1啟動(dòng)子。之所以采用RNA pol III啟動(dòng)子是由于它可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子RNA，而且它是通過(guò)添加一串（3到6個(gè)）U來(lái)終止轉(zhuǎn)錄的。要使用這類載體，需要訂購(gòu)2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應(yīng)載體的pol III 啟動(dòng)子下游。由于涉及到克隆，這個(gè)過(guò)程需要幾周甚至數(shù)月的時(shí)間，同時(shí)也需要經(jīng)過(guò)測(cè)序以保證克隆的序列是正確的。siRNA表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)在于可以進(jìn)行較長(zhǎng)期研究——帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。

病毒載體也可用于siRNA表達(dá)，其優(yōu)勢(shì)在于可以直接率感染細(xì)胞進(jìn)行基因沉默的研究，避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來(lái)的種種不便,而且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定。zui適用于：已知一個(gè)有效的siRNA序列，需要維持較長(zhǎng)時(shí)間的基因沉默。不適用于：篩選siRNA序列（其實(shí)主要是指需要多個(gè)克隆和測(cè)序等較為費(fèi)時(shí)、繁瑣的工作）。

5. siRNA表達(dá)框架

siRNA表達(dá)框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達(dá)模版，包括一個(gè)RNA pol III啟動(dòng)子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA，一個(gè)RNA pol III終止位點(diǎn)，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無(wú)需事前克隆到載體中。和siRNA表達(dá)載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測(cè)序等頗為費(fèi)時(shí)的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時(shí)間。因此，SECs成為篩選siRNA的zui有效工具，甚至可以用來(lái)篩選在特定的研究體系中啟動(dòng)子和siRNA的zui適搭配。如果在PCR兩端添加酶切位點(diǎn)，那么通過(guò)SECs篩選出的zui有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構(gòu)建siRNA表達(dá)載體。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達(dá)siRNA和長(zhǎng)效抑制的研究。

這個(gè)方法的主要缺點(diǎn)是①PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中（晶賽公司的Protocol可以解決這一問(wèn)題）②不能進(jìn)行序列測(cè)定，PCR和DNA合成時(shí)可能差生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致結(jié)果不理想。zui適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選*啟動(dòng)子不適用于：長(zhǎng)期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了）

(三)siRNA的轉(zhuǎn)染

將制備好的siRNA，siRNA表達(dá)載體或表達(dá)框架轉(zhuǎn)導(dǎo)至真核細(xì)胞中的方法：

將氯化鈣，RNA(或DNA)和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜并通過(guò)胞飲進(jìn)入目的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。沉淀物的大小和質(zhì)量對(duì)于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。在實(shí)驗(yàn)中使用的每種試劑都必須小心校準(zhǔn)，保證質(zhì)量，因?yàn)樯踔疗x*條件十分之一個(gè)pH都會(huì)導(dǎo)致磷酸鈣轉(zhuǎn)染的失敗。

注意事項(xiàng)

為了達(dá)到高的轉(zhuǎn)染效率，在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需要注意以下幾點(diǎn)：

1.純化siRNA

在轉(zhuǎn)染前要確認(rèn)siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結(jié)合，洗脫或通過(guò)15-20%丙烯酰胺膠除去反應(yīng)中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學(xué)合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。

2.避免RNA酶污染

微量的RNA酶將導(dǎo)致siRNA實(shí)驗(yàn)失敗。由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)，所有徒手接觸過(guò)的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實(shí)驗(yàn)每個(gè)步驟不受RNA酶污染非常重要。

3.健康的細(xì)胞培養(yǎng)物和嚴(yán)格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性

通常，健康的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞的穩(wěn)定性。為了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，推薦用50代以下的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率會(huì)隨時(shí)間明顯下降。

4.避免使用抗生素

Ambion公司推薦從細(xì)胞種植到轉(zhuǎn)染后72小時(shí)期間避免使用抗生素。抗生素會(huì)在穿透的細(xì)胞中積累毒素。有些細(xì)胞和轉(zhuǎn)染試劑在siRNA轉(zhuǎn)染時(shí)需要無(wú)血清的條件。這種情況下，可同時(shí)用正常培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)基做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，以得到*轉(zhuǎn)染效果。

5.選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑

針對(duì)siRNA制備方法以及靶細(xì)胞類型的不同，選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對(duì)siRNA實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。

6.通過(guò)合適的陽(yáng)性對(duì)照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測(cè)條件

對(duì)大多數(shù)細(xì)胞，看家基因是較好的陽(yáng)性對(duì)照。將不同濃度的陽(yáng)性對(duì)照的siRNA轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞（同樣適合實(shí)驗(yàn)靶siRNA），轉(zhuǎn)染48小時(shí)后統(tǒng)計(jì)對(duì)照蛋白或mRNA相對(duì)于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的降低水平。過(guò)多的siRNA將導(dǎo)致細(xì)胞毒性以至死亡。

7.通過(guò)標(biāo)記siRNA來(lái)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

熒光標(biāo)記的siRNA能用來(lái)分析siRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。標(biāo)記的siRNA還可用作siRNA胞定位及雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（配合標(biāo)記抗體）來(lái)追蹤轉(zhuǎn)染過(guò)程中導(dǎo)入了siRNA的細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達(dá)的下調(diào)結(jié)合起來(lái)。